物語はTVシリーズ第3シーズンの結末、トワイライトスパークルがアリコーンに進化し新たなプリンセスとして戴冠した後の生活から続く。水晶帝国の貴重な王冠が盗まれた今、トワイライトプリンセスはその重大な任務を引き受け、単身で別の平行世界へ向かう。そこで彼女は、平行世界のスパイクが犬になり、自分自身は両手を持ち二足歩行する人間に変身していることを発見する。彼女は女子高生という身分となり、人間バージョンに化身したポニーの友達たちと再会することになる……