『Hi Hi Puffy AmiYumi』は、仲良し二人組の冒険を描く。元気で楽天的、明るく女の子らしい**Ami Onuki**（声：Janice Kawaye）と、皮肉屋でシニカル、不機嫌なボーイッシュな**Yumi Yoshimura**（声：Grey DeLisle）。二人は日本のポップデュオ、Puffy AmiYumiがモデルだが、外見は異なり、性格も誇張されている。善意だが欲深いマネージャー、**Kaz Harada**（声：Keone Young）と共に、カスタマイズされたツアーバスで世界中を旅する。コンサートで盛り上がることもあれば、故郷の東京でぶらぶらすることも。二人は音楽の才能、トレンドセッターなスタイル、ユーモアで世界を席巻し、J-POPジャスティスの教訓を説きながら、「クール」という国際言語を確立していく。 サブキャラクターには、Kazを困らせるのが好きな二人のペット猫、**Jang-Keng**（声：Grey DeLisle）と**Tekirai**（声：Janice Kawaye）がいる。他にも、自称Puffy AmiYumi（後にKazも）の「ナンバーワンファン」で、彼らを常にストーキングする6歳の少女**Harmony**（声：Sandy Fox）。邪悪な土地開発業者で、自分勝手な目的で人々が愛する場所を破壊しようとする**Eldwin Blair**（声：Nathan Carlson）。トランシルバニア出身の吸血鬼ロックトリオ、邪悪な**Talent Suckers**（声：Nathan Carlson、Corey Burton）。そして、パンクバンドNew Rote'kaのボーカル、Atsushiを風刺したキャラクターで、三人称で話し、自分をスーパーヒーローだと思い込んでいる**Atchan**（声：Rob Paulsen）が登場する。 アニメ版Puffy AmiYumiは、ツアーバスで世界中を旅する。外見は普通のバスと同じ大きさだが、内部には二人の部屋（フルサイズベッド付き）、Kazの部屋、機材、テレビ、コンピューターなどが十分に収容されているようだ。「Domo」のエピソードでは、Kazが「上の階」について言及している。また、自動運転も可能なようで、移動中にKaz、Ami、Yumiがバスの後部キャビンに座っている場面もある。時折、スクーターの少年が届ける荷物を受け取るために後部ドアが開けられることもある。 第1シーズンでは、各エピソードの冒頭と終わりに、本物のAmiとYumiが子供っぽいコメント（英語と字幕なしの日本語）をしている実写クリップが含まれていた。第2シーズンと第3シーズンでは、番組冒頭の短いクリップのみとなった。第2シーズンからは、二人がアニメパートを紹介するタイトルカードを持っている場面も見られた。「Sitcomi Yumi」のエピソード終わりでは、AmiとYumiがテレビを見て、アニメのKazと実写のAmiとYumiが映っているのを目撃する。すべての実写クリップはFreegate, Ltd.によって制作された。 本物のPUFFYがアニメの主題歌（各国では日本語、ドイツ語、スペイン語、ポルトガル語版も存在）を歌い、多くのエピソードで彼女たちの曲の一つ以上がバックグラウンドで流れる。Andy Sturmerの音楽も使用されている。 キャラクターは英語を話すが、脚本には彼らの口語に日本語が散りばめられており、特に驚くような出来事に対する反応として使われる。「助けて！」の代わりに「たすけて！」と叫ぶのはよくあるパターンだ。