ある日、レイトン教授はオペラのチケットが同封された手紙を受け取る。差出人は、レイトン教授の元教え子で、今や世界的に有名なオペラ歌手「ジャニス」。彼女は手紙の中で、一年前に亡くなったはずの親友「ミリーナ」が、7歳の少女の姿で現れ、「永遠の命」を得たと主張していると記していた。この奇妙な内容の手紙を読んだレイトンは、不可解な事件の真相を解明するため、少年ルークと助手レミーと共に、オペラが上演される大劇場へと向かう。三人が現場に到着すると、その夜の演目は作曲家ヴィスラーの最新作で、古代の不老不死の王国「アンブロシア」の伝説を基にしたものだった。この不死の伝説は、ちょうどレイトン教授の恩師であるレイダー博士が生涯をかけて探求してきた謎でもあった。しかし、レイトンがさらに驚くべき秘密を発見するのは、劇場に集まった観客たちの真の目的が、実は「永遠の命」を求めるものだったということ。舞台に現れた不気味な仮面の男は、永遠の命を得られるのはただ一人だと宣言する。最後の勝者を選ぶため、場にいる全員が推理と謎解きの競争に参加しなければならない。